实验报告：

一、HCCC-9810(胆管细胞型肝癌细胞)分离与培养：

    1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将组织剪成1mm3左右大小；

    2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

    3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；

    4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

    5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；

二、免疫荧光鉴定：

    1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

    2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

    3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

    4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗（Abbioscience公司），然后将其放在4℃箱中孵育细胞过夜；

    5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

    6、用PBS冲洗3次，每次10min，最后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

特性：

安全性：所有肿瘤和病转染的细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需高压灭菌后方能丢弃。收到细胞后，在倒置镜下好是在4X物镜)观察整个细胞生长情况

（一）如果细胞未长满，用75%酒精喷洒整个瓶消后放到超菌台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，吸出培养液，换 10ml新鲜培养液后继续培养。

(二)如果细胞已长满，即可进行传代培养。具体步骤如下：

1. 弃去培养液，用PBS（不含钙,镁离子）洗1-2次。

2. 加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，倒放于37℃培养箱1-3分钟预热，之后翻转培养瓶10-30秒后，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量完全培养基终止消化。

3. 按6-8ml/瓶补加完全培养基，轻轻打匀后吸出一半，分到新的培养瓶中。

细胞特性：

1)组织来源于实验动物的正常眼组织。

2)细胞鉴定：细胞角蛋白-18(CK-18)免疫荧光染色为阳性。

3)经鉴定细胞纯度高于90%。

4)不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

5)细胞生长方式：上皮样，不规则细胞，贴壁培养。

注意事项：

1、观察细胞zui好在低倍镜（4或5X物镜)下进行，否则不能准确判断细胞的传代密度。看细胞的形态请在10X或20X物镜下。

2、瓶中运输培养基不能重复再用,请换用加双抗的新培养基，细胞冻存后,培养基中可不加任何抗生素。

3、有些细胞贴壁不牢，如发现贴壁细胞有脱落，可离心吹打后接种到新瓶内。

4、收到细胞后，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请及时与我们。

CPLX2 (Complexin-2) ELISA KITPorcine BALP(Bone Alkaline Phosphatase) ELISA Kit2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷细胞单胺氧化酶B型（MAO－B）活性荧光定量检测试剂盒

CLK1 (Dual specificity protein kinase CLK1) ELISA KITPorcine BDNF(Brain Derived Neurotrophic Factor) ELISA KitN-α-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酸组织单胺氧化酶B型（MAO－B）活性荧光定量检测试剂盒

CYP3A5(Cytochrome P450 3A5) ELISA KitPorcine bFGF/FGF2(Basic Fibroblast Growth Factor) ELISA KitN,N,N',N'',N''-五甲基二乙烯基三胺体液单胺氧化酶B型（MAO－B）活性荧光定量检测试剂盒

CLPTM1 (Cleft lip and palate transmembrane protein 1 homolog) ELISA KITPorcine BK(Bradykinin) ELISA KitN,N,N',N'',N''-五甲基二乙烯基三胺细胞单胺氧化酶（MAO）总活性化学发光法定量检测试剂盒

CORIN (Atrial natriuretic peptide-converting enzyme) ELISA KITPorcine BMP-2(Bone Morphogenetic Protein 2) ELISA Kitβ-萘酚组织单胺氧化酶（MAO）总活性化学发光法定量检测试剂盒

CLK3 (Dual specificity protein kinase CLK3) ELISA KITPorcine BMP-4(Bone Morphogenetic Protein 4) ELISA Kit新胭脂红体液单胺氧化酶（MAO）总活性化学发光法定量检测试剂盒

CORT (Cortistatin) ELISA KITPorcine BNP(Brain Natriuretic Peptide) ELISA Kit新胭脂红细胞单胺氧化酶A型（MAO－A）活性化学发光法定量检测试剂盒

CLUL1 (Clusterin-like protein 1) ELISA KITPorcine C3(Complement Component 3) ELISA Kit碱式碳酸镍组织单胺氧化酶A型（MAO－A）活性化学发光法定量检测试剂盒

PIGA ELISA KitUGDH/UDPGDH  尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶抗体3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪盐酸盐化苦参（苦参）进口/国产phospho-c-Abl(Ser735)  酸化非受体酪氨酸激酶c-Abl抗体含量：HPLC≥98%

PIGB ELISA KitUricase  尿酸酶1,3,5-三甲基吡唑酸进口/国产phospho-c-Abl(Tyr89)  酸化非受体酪氨酸激酶c-Abl抗体含量：HPLC≥98%

PI3K p55(gamma) ELISA KitNALP2/PAN1/PYPAF2  富含亮氨酸重复结构域蛋白2抗体1,3,5-三甲基吡唑辛酸进口/国产phospho-c-Abl(Tyr251)  酸化非受体酪氨酸激酶c-Abl抗体含量：HPLC≥98%

KLB(Beta-klotho) ELISA KitDystrophin/DMD  肌营养不良蛋白1,3,5-三恶烷盐酸氨葡萄糖进口/国产phospho-c-Abl(Tyr272)  酸化非受体酪氨酸激酶c-Abl抗体含量：HPLC≥98%

PI4K2A ELISA KitLGI1/ETL1  富含亮氨酸胶质瘤失活蛋白1抗体3-(三氟甲基)苯胺罗通定进口/国产phospho-c-Abl(Tyr276)  酸化非受体酪氨酸激酶c-Abl抗体含量：HPLC≥98%

PIGK ELISA KitGANAB/alpha Glucosidase II  α葡萄糖苷酶2抗体3-(三氟甲基)苯胺落新妇苷进口/国产SPTLC1  丝氨酸棕榈酰转移酶1抗体含量：HPLC≥98%

PIGM ELISA KitNLG1/KIRREL2  肾病样蛋白1抗体三苯基氧膦芦进口/国产SLC27A5  脂肪酸转运蛋白5抗体含量：UV≥98%

PHKA1 ELISA KitMAPK organizer 1/Morg1  丝裂原活化蛋白激酶组织蛋白1抗体三苯基氧膦雷公藤进口/国产Clathrin heavy chain/Clathrin HC  网格蛋白重链抗体含量：HPLC≥98%

特性：

安全性：所有肿瘤和病转染的细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需高压灭菌后方能丢弃。收到细胞后，在倒置镜下好是在4X物镜)观察整个细胞生长情况

（一）如果细胞未长满，用75%酒精喷洒整个瓶消后放到超菌台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，吸出培养液，换 10ml新鲜培养液后继续培养。

(二)如果细胞已长满，即可进行传代培养。具体步骤如下：

1. 弃去培养液，用PBS（不含钙,镁离子）洗1-2次。

2. 加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，倒放于37℃培养箱1-3分钟预热，之后翻转培养瓶10-30秒后，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量完全培养基终止消化。

3. 按6-8ml/瓶补加完全培养基，轻轻打匀后吸出一半，分到新的培养瓶中。