测定原理:
PDC催化丙酮酸脱羧生成乙醛,添加乙醇脱氢酶(ADH)来进一步催化NADH还原乙醛生成乙醇
和NAD+;NADH 在340nm有吸收峰,而NAD+没有;通过测定340nm光吸收下降速率,来计算PDC活性。
自备仪器或用品:
研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计、1mL石英比色皿、可调式移液枪和蒸馏水。
试剂盒组成(50T/48 样):
试剂一:液体×1 瓶,4°C保存。
试剂二:液体×1 瓶,4°C保存。
试剂三:液体×1 瓶,4°C保存。
试剂四:粉剂×1 瓶,﹣20°C保存。
试剂五:液体×1 瓶,﹣20°C保存。
混合试剂:临用前配制,小心把试剂四和五转移到试剂三中,充分溶解。
试剂六:液体×1 瓶,4°C保存。
粗酶液提取:
粗酶液提取详见试剂盒内说明书。测定细菌、组织和细胞时需要测定蛋白浓度。
操作步骤:
| 空白管 | 测定管 |
双蒸水(ml) | 0.1 |
|
待测样本(ml) |
| 0.1 |
混合试剂(ml) | 0.1 | 0.1 |
试剂二(ml)(已25°C预温) | 0.7 | 0.7 |
试剂六(ml) | 0.1 | 0.1 |
立即混匀,计时,倒入1ml石英比色皿中,波长340nm,双蒸水调零,
测定15s吸光度值A15和75s时吸光度值A75;计算△A=A15-A75。