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L-半乳糖苷-1,4-内酯脱氢酶(Gal LDH)测试盒(可见分光光度法)
L-半乳糖苷-1,4-内酯脱氢酶(Gal LDH)测试盒(可见分光光度法)图片
货号:GLDH-2-W
包装:50管/48样


产品介绍

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

L-半乳糖途径是合成 AsA 的主要途径。Gal LDH 位于线粒体内膜,负责催化植物体内 AsA 生物合成的最后一步,也是该途径的关键酶之一,对植物体内 AsA 含量的积累起着至关重 要的作用。

测定原理:

Gal LDH 催化 L-半乳糖内酯还原细胞色素 c(Cyt c),还原型 Cyt c 在 550nm 有吸收峰;测 定还原型 Cyt c 增加速率,来计算 Gal LDH 活性。

自备仪器和用品:

台式离心机、可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一:液体 50mL×1 瓶,4℃保存。

试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加入 40mL 蒸馏水,充分溶解。

试剂三:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加入 5mL 蒸馏水,充分溶解。

粗酶液提取:

按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL试剂一)进行冰浴匀浆。13000g,4℃离心 10min,取上清置冰上待测。

Gal LDH 测定操作:

1. 分光光度计预热 30 min,调节波长到 550nm,蒸馏水调零。

2. 试剂二在 25℃水浴锅中预热 30 min。

3. 依次在 1mL 玻璃比色皿中加入 100μL 上清液、800μL 预热的试剂二和 100μL 试剂三,迅 速混匀后于 550nm 比色,记录 10s 和 130s 的吸光值 A1 和 A2,△A = A2﹣A1。

Gal LDH 活性计算公式:

(1). 按蛋白浓度计算

Gal LDH 活性单位定义:25℃中每毫克蛋白每分钟还原 1μmol Cyt c  为 1 个酶活单位。

Gal LDH (μmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V 反总×106÷(Cpr×V 样)÷T=289×△A ÷Cpr

(2). 按样本质量计算

Gal LDH 活性单位定义:25℃中每克样品每分钟还原 1μmol Cyt c  为 1 个酶活单位。

Gal LDH (μmol/min/g 鲜重) = △A÷ε÷d×V 反总×106÷(W×V 样÷V 样总)÷T=289×△A ÷W

ε:还原型 Cyt c 摩尔消光系数,17.3×103L/ mol/cm;d:比色皿光径(cm),1cm;V 反总:反 应体系总体积,1mL=0.001 L;106:1mol=1×106μmol;V 样:加入反应体系中上清液体积,100μL=0.1mL;Cpr:上清液蛋白浓度,mg/mL,蛋白质浓度需要另外测定,建议使用本公司蛋白质含量 BCA 试剂盒;V 样总:加入提取液体积,1mL;W,样本质量,g;T:反应 时间,2min。

注意事项:

试剂二和试剂三配制好后 3 天内使用完。

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