正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

二磷酸核酮糖羧化酶(EC 4.1.1.39)是植物光合作用中的一个关键酶，既控制着CO2的固定， 同时又制约着碳素向Calvin循环和光呼吸循环分流，其活性的大小直接影响着光合速率。

测定原理：

在 Rubisco 的催化下，1 分子的核酮糖-1，5-二磷酸(RuBP)与 1 分子的 CO2 结合，产生 2 分子的 3-磷酸甘油酸(PGA)，PGA 可通过外加的 3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，产生甘油醛-3-磷酸，并使还原型辅酶 I(NADH)氧化。因此，340nm 吸光度的变化可计算还原型辅酶 I 氧化速率，还原型辅酶 I 氧化速率可反应 Rubisco 的活性。

需自备的仪器和用品： 分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、 冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液一：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。 提取液二：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：25mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 10mL 试剂一，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 10mL 试剂一，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂四：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 1 mL 试剂一，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

(注意：试剂二、三、四溶解后，按需分装-20℃保存。)

粗酶液制备：

①总 Rubisco 酶提取：建议称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液一，冰浴匀浆后超声破碎(冰浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min)，然后 4℃，8000g 离心 10min，取上清测定。

②胞浆和叶绿体 Rubisco 酶的分离：按照植物组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5～10 的比例(建议称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液一)，冰浴匀浆后于 4℃，200g 离心 5min， 弃沉淀，取上清在 4℃，8000g 离心 10min，取上清用于测定胞浆 Rubisco 酶活性，取沉淀加 1mL 提取液二，震荡溶解后超声破碎(冰浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min)， 然后 4℃，8000g 离心 10min，取上清测定叶绿体中 Rubisco 酶活性。

建议测定总 Rubisco 酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的Rubisco，则按照步骤②提取粗酶液。

(注意：粗酶液制备过程中超声破碎操作使用细胞破碎仪进行。)

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

(1) 工作液的配制：临用前将试剂二和试剂三 1：1 混合，用多少配多少；

(2) 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10uL 样本、10uL 试剂四和 180uL 工作液，混匀， 立即记录 340nm 处 20s 时吸光值 A1 和 5min20s 时的吸光值 A2，计算ΔA=A1-A2。

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

1、按样本蛋白浓度计算

单位的定义：25℃中 1 mg 蛋白 1 min 氧化 1 nmol NADH。

Rubisco(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T =643×ΔA÷Cpr

此法需要测定粗酶液中蛋白质浓度，建议选购本公司生产的 BCA 蛋白质浓度测定试剂盒。

2、按样本鲜重计算

单位的定义：25℃中 1 g 组织 1 min 氧化 1nmol NADH。

Rubisco(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=643×ΔA÷W

上述计算公式中各符合含义：

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5min；W：样本质量，g。

b.使用 96 孔板测定的计算公式如下：

1、按样本蛋白浓度计算

单位的定义：25℃中 1 mg 蛋白 1 min 氧化 1 nmol NADH。

Rubisco(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T =1286×ΔA÷Cpr

此法需要测定粗酶液中蛋白质浓度，建议选购本公司生产的 BCA 蛋白质浓度测定试剂盒。

2、按样本鲜重计算

单位的定义：25℃中 1 g 组织 1 min 氧化 1nmol NADH。

Rubisco(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=1286×ΔA÷W

上述计算公式中各符合含义：

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，5 min；W：样本质量，g。