正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

MCS 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，与柠檬酸合酶(CS)共同参与三羧酸循环的调节。

测定原理：

MCS 催化丙酰 CoA 和草酰乙酸产生甲基柠檬酰辅酶 A，进一步水解产生甲基柠檬酸；该反应促使无色的 DTNB 转变成黄色的 TNB，在 412nm 处有特征吸光值。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、 研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水

试剂组成和配制：

试剂一：液体 100mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂二：液体 20mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂三：液体 1.5mL×1 支，-20℃保存；

试剂四：液体 30mL×1 瓶，4℃保存；

试剂五：粉剂×1 瓶，4℃保存；

试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存，临用前加入 1mL 蒸馏水，用不完的试剂仍-20℃保存；

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

①   称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL  试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

②   将匀浆 600g，4℃离心 5min。

③   弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

④   上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 CS(此步可选做)。

⑤   在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎(冰浴，功率 20%或200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次)，用于线粒体 CS 测定。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 412nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

(1)在试剂五中加入 1mL 无水乙醇和 22mL 试剂四，混匀，37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)孵育 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

(2)在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、220μL 试剂五和 10μL 试剂六，混匀，记录 412nm 处 20 秒时的初始吸光度 A1 和 2 分 20 秒时的吸光度 A2，计算 ΔA=A2-A1。

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

MCS(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T=880×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

MCS(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=177.8×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

MCS(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.3556×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2.4×10^-4 L；ε：TNB 摩尔消光系数，1.36×104 L/ mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T： 反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。

b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下：

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

MCS(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T=1760×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

MCS(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=355.6×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

MCS(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.711×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2.4×10^-4 L；ε：TNB 摩尔消光系数，1.36×10⁴ L/ mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL； T：反应时间，2  min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。