注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

脯氨酸是植物体内适应逆境胁迫的一种重要的渗透调节物质。高等植物中脯氨酸代谢因其初始底物不同，分为谷氨酸( Glu)和鸟氨酸( Orn)两条合成途径。鸟氨酸转氨酶( δ-OAT)是是以鸟氨酸为前体合成脯氨酸途径的关键酶，对植物适应逆境胁迫起关键作用。

测定原理

鸟氨酸和α-酮戊二酸在鸟氨酸转氨酶和 NADH作用下发生氨基转移反应生成吡咯啉-5-羧酸(P5C)，同时产生 NAD，通过检测 340nm处的吸光度的变化可反映出鸟氨酸转氨酶活性的高低。

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、研钵、酶标仪、96孔板。

试剂组成和配制

提取液：液体 110mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体 30 mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加 8mL试剂一充分溶解；用不完的试剂 4℃保存。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加 8mL试剂一充分溶解；用不完的试剂 4℃保存。

试剂四：粉剂×2瓶，-20℃保存；临用前每瓶加 4mL试剂一充分溶解；现配现用。

酶液提取

1.组织：按照质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5～10的比例(建议称取约 0.1g，加入 1mL提取液)加入提取液，冰浴匀浆后于 4℃，10000g离心 10min，取上清置冰上待测。

2.细胞：按照细胞数量(10⁴个)：提取液体积(mL)为 500～1000：1的比例(建议 500万细胞加入 1mL提取液)，冰浴超声波破碎细胞(功率 300w，超声 3秒，间隔 7秒，总时间 3min)；然后 4℃，10000g离心 10min，取上清置冰上待测。

3.液体：直接检测。

测定操作

1.酶标仪预热 30min，调节波长至 340nm。

2.将配好的试剂二、三、四 37℃预热 5min。(注意：粉剂试剂需要自行配制)

3.取 96孔板，依次加入 60μL试剂二，60μL试剂三，60μL试剂四，20μL粗酶液，充分混匀，记录 340nm处初始吸光值和 37℃反应 10min的吸光值 A2，△A=A1-A2。

用 96孔板测定的计算公式如下

(1)按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

δ-OAT(nmol/min/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×Cpr)÷T=321.54×ΔA÷Cpr

(2)按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

δ-OAT(nmol/min/g鲜重)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷(W ×V样÷V样总)÷T=321.54×ΔA÷W

(3)按照细胞数量计算

酶活单位定义：每 10⁴个细胞每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

δ-OAT(nmol/min/10⁴ cell)= ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总)÷T=321.54×ΔA÷细胞数量

(4)按照液体体积计算

酶活单位定义：每毫升液体每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

δ-OAT(nmol/min/mL)＝ΔA÷(ε×d)×V反总÷V样÷T=321.54×ΔA

V反总：反应体系总体积，0.2mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/ mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g