SDH(EC 1.3.5.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。SDH是线粒体的一种标志酶，位于线粒体内膜上的一种膜结合酶，是连接呼吸电子传递和氧化磷酸化的枢纽之一。此外，为多种原核细胞产能的呼吸链提供电子。

SDH催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下的氢通过吩嗪二甲酯硫酸(PMS)传递还原2,6-二氯酚靛酚(DCPIP)，并且在600nm处具有特征吸收峰，通过600nm吸光度的变化，测定2,6-DCPIP的还原速度，代表SDH酶活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容：

溶液的配制：

1.试剂四：临用前加入到试剂三中溶解待用；

2.试剂五：临用前加入4ml双蒸水，用不完的试剂仍4℃保存；

3.试剂六：临用前加入3.333ml双蒸水，用不完的试剂4℃保存。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理(可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献)

准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1ml试剂一和10μL试剂二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆充分研磨，4℃ 11000g离心10min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至600nm，蒸馏水调零。样本测定。

在加入试剂六的同时开始计时，在600nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1和1分20秒时的吸光度A2，计算ΔA=A1-A2，得到ΔA测定、ΔA空白。

三、SDH活性的计算

a.用微量比色皿测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

SDH活性(U/mg prot)=[(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总×10⁹ ]÷(Cpr×V样)÷T=952.381×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr

(2)按样本质量计算

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

SDH活性(U/g质量)=[(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总×10⁹ ]÷(V样÷V样总×W)÷T=961.905×(ΔA测定-ΔA空白)÷W

(3)按细菌或细胞数量计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

SDH活性(U/10⁴ cell)=[(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总×10⁹ ]÷(V样÷V样总×500)÷T=1.924×(ΔA测定-ΔA空白)

V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×10⁴L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01ml；V样总：加入试剂一和试剂二体积，1.01ml；T：反应时间，1min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万；109：单位换算系数，1mol=109nmol。

b.用96孔板测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

SDH活性(U/mg prot)=[(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总×10⁹ ]÷(Cpr×V样)÷T=1587.302×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr

(2)按样本质量计算

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

SDH活性(U/g质量)=[(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总×10⁹ ]÷(V样÷V样总×W)÷T=1603.175×(ΔA测定-ΔA空白)÷W

(3)按细菌或细胞数量计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

SDH活性(U/10⁴cell)=[(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总×10⁹ ]÷(V样÷V样总×500)÷T=3.206×(ΔA测定-ΔA空白)

V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×10⁴L/mol/cm；d：96孔板光径，0.6cm；V样：加入样本体积，0.01ml；V样总：加入试剂一和试剂二体积，1.01ml；T：反应时间，1min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万；109：单位换算系数，1mol=109nmol。

注意事项：

1.测定过程中所有试剂和样本在冰上放置，以免变性失活。

2.若ΔA大于0.5(比色皿)/0.3(96孔板)，需将酶液用酶提取液稀释，使ΔA小于0.5/0.3，可提高检测灵敏度。

3.由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约1mg/ml)，所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。