花青素还原酶(ANR)是原花青素生物合成途径中的关键酶，使花色素转变为相应的顺式黄烷-3-醇，在植物体内起着非常重要的调控作用。

NADpH在ANR作用下将花色素转化为黄烷-3-醇和NADP，在340nm下测定NADpH的减少速率，即可反映ANR活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容：

溶液的配制：

1.提取液：内含不溶物，使用前摇匀。

2.试剂二：临用前加入1ml蒸馏水备用。

3.试剂三：粉剂置于试剂瓶内玻璃管中。临用前加入1ml乙醇和1ml蒸馏水混匀溶解备用。可以分装后-20℃保存，避免反复冻融。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器、乙醇、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理(可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献)

1.组织：称取约0.1g组织，加入1ml提取液进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心15分钟，取上清，置冰上待测。

2.细胞或细菌样本的制备：先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每500万细胞或细菌加入1ml提取液，超声波破碎细菌或细胞(功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次)。12000g，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。

二、测定操作

1.紫外分光光度计/酶标仪预热30min，波长调至340nm，蒸馏水调零。

2.加样表：

混匀后测量测定管和对照管在340nm下的吸光度，分别记为A测定管、A对照管，计算ΔA=A对照管-A测定管。

三、ANR酶活计算

1.按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟减少1nmol NADpH的酶量定义为一个酶活性单位。

ANR酶活(U/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×10⁹×V反总]÷(V样×Cpr)÷T =107.18×ΔA÷Cpr

2.按样本质量计算：

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟减少1nmol NADpH的酶量定义为一个酶活性单位。

ANR酶活(U/g质量)=[ΔA÷(ε×d) ×10⁹×V反总]÷(W÷V提取×V样)÷T =107.18×ΔA÷W

3.按细胞或细菌个数计算：

单位的定义：每104个细胞或细菌在反应体系中每分钟减少1nmol NADpH的酶量定义为一个酶活性单位。

ANR酶活(U/10⁴cell)=[ΔA÷(ε×d) ×10⁹×V反总]÷(500÷V提取×V样)÷T =0.2144×ΔA V反总：反应总体积，2×10^-4L；ε：NADpH的摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入的样本体积，0.01ml；Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml；W：样本质量，g；V提取：提取液体积，1ml；500：500万个细胞；T：反应时间，30min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。

B、按96孔UV板计算：

将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm(96孔UV板光径)进行计算即可。

注意事项：

1.当ΔA大于0.4或者A对照管大于1(96孔UV板为ΔA大于0.2或者A对照管大于1)时，建议将反应混合液用试剂一稀释更大倍数或者减少加入的样本体积进行测定；ΔA过小时，可以增加酶促反应时间(45min或60min)或增加加入的样本体积来测定。

2.加入试剂四后，请在15min内测定完成。

3.样本蛋白浓度另行测定。