检测原理:
线粒体呼吸链复合物I，通常称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶Q还原酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide coenzyme Q reductase, NADH-CoQreductase），又称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶（reduced nicotinamide adeninedinucleotide dehydrogenase；NADH dehydrogenase），是线粒体电子传递链中***结构
成分：含有30至40多个多肽结构。其特征性的酶活性是鱼藤酮敏感的NADH－辅酶Q还原酶（NADH:Q Reductase）。复合物I催化线粒体内电子由供体NADH传递到内膜上辅酶Q受体（泛醌；ubiquinone）的能量转移反应，为整个呼吸链反应系统的**步。基于辅酶Q底物，在鱼藤酮存在与否的情况下，通过NADH－辅酶Q还原酶的催化，转化成还原型泛醌（CoQH2），同时还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adeninedinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adeninedinucleotide；NAD），在分光光度仪下产生吸收峰值的变化（340nm 波长），由此定量测定NADH－辅酶Q还原酶的特异活性。其反应系统是：
NADH:Q Reductase
NADH + H＋ + CoQ ---------------------------------> NAD－ + CoQH2
试剂组成：（20 管/10 样)）
缓冲液（Reagent A） 20 毫升
反应液（Reagent B） 2.5 毫升
阴性液（Reagent C） 2 毫升
底物液（Reagent D） 500 微升
专性液（Reagent E） 200 微升
产品说明书 1 份
保存方式
-20°C冰箱保存，避免反复冻融；反应液（Reagent B）含有毒性物质，避免直接用手接触；反应液（Reagent B）和底物液（Reagent D），避免光照，有效保证6个月
用户自备
比色皿：用于比色分析的容器
双波长分光光度仪：用于比色分析
培养箱：用于孵育反应物
实验步骤
实验开始前，将－20°C冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；缓冲液（Reagent A）室温预热；反应液（Reagent B）和底物液（Reagent D）注意避光。然后进行下列操作。
（一）、背景对照测定
1、移取 780 微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
2、加入 100 微升反应液（Reagent B）
3、加入 20 微升底物液（Reagent D）
4、放进 30°C培养箱里静置 3 分钟
5、加入 100 微升阴性液（Reagent C）
6、上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）
7、即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：
（340 波长读数－380 波长读数）0 分钟－（340 波长读数－380 波长读数）1 分钟或 3 分钟
（二）、样品总活性测定
1、移取 780 微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
2、加入 100 微升反应液（Reagent B）
3、加入 20 微升底物液（Reagent D）
4、放进 30°C培养箱里静置 3 分钟
5、加入 100 微升待测样品（注意：10微克总线粒体蛋白）
6、上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）
7、即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：
（340 波长读数－380 波长读数）0 分钟－（340 波长读数－380 波长读数）1 分钟或 3 分钟
（三）、样品非特异活性测定
1、移取 760 微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
2、加入 100 微升反应液（Reagent B）
3、加入 20 微升专性液（Reagent E）
4、加入 20 微升底物液（Reagent D）
5、放进 30°C培养箱里静置 3 分钟
6、加入 100 微升待测样品（注意：10微克总线粒体蛋白）
7、上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）
8、即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：
（340 波长读数－380 波长读数）0 分钟－（340 波长读数－380 波长读数）1 分钟或 3 分钟
样品活性计算:
（1）、样品活性（总活性或非特异活性）
单位：μmol NADH/min/mgprot
（2）、样品特异活性
样品总活性－样品非特异活性＝样品特异活性
