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细胞壁不溶性酸性转化酶(B-AI)测试盒(可见分光光度法)
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货号: BAI-2-Y
包装: 50管/24样
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货号:BAI-2-Y
产品介绍

正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

蔗糖转化酶(Invertase,Ivr)催化蔗糖不可逆地分解为果糖和葡萄糖,是高等植物蔗糖代谢关键酶之一。根据最适 pH,Ivr分为酸性转化酶(AI)和中性转化酶(NI)两种类型。

AI的最适 pH为 3~5。AI分为可溶性 AI(S-AI)和细胞壁不溶性 AI(B-AI)两种类型。 B-AI存在于细胞间隙并结合在细胞壁上,主要参与韧皮部质外体卸载时蔗糖的分解,以维持库源之间蔗糖的浓度。

测定原理:

B-AI催化蔗糖降解产生还原糖,进一步与 3,5-二硝基水杨酸反应,生成棕红色氨基化合物,在 510nm有特征光吸收,在一定范围内 510nm光吸收增加速率与 B-AI活性成正比。

自备用品:

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制:

提取液 1:液体 50mL×1瓶,4℃保存;

提取液 2:液体 50mL×1瓶,4℃保存;

试剂一:液体 50mL×1瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存;临用前加入 25mL试剂一充分溶解备用;用不完的试剂 4℃保存;

试剂三:液体 30mL×1瓶,4℃保存;

粗酶液提取:

按照组织质量(g):提取液 1体积(mL)为 1:5~10的比例(建议称取约 0.1g组织,加入 1mL提取液 1),进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心 10min,弃上清,沉淀中加入 1mL蒸馏水,充分震荡混匀,12000g 4℃离心 10min,弃上清,沉淀中加入 1mL提取液 2充分混匀,4℃浸提过夜,12000g 4℃离心 20min,取上清置冰上待测。

测定步骤和加样表:

试剂名称(μL)测定管对照管
样本200200
试剂一
800
试剂二800
混匀, 37℃准确水浴 30min后,95℃水浴 10min(盖紧,以防水分散失),流水冷却后充分混匀(以保证浓度不变)
试剂三
500500

混匀,95℃水浴 10min(盖紧,以防止水分散失),流水冷却后充分混匀, 510nm处,蒸馏水调零,记录各管吸光值 A,如果吸光值大于 2,可以用蒸馏水稀释后测定(计算公式中乘以相应稀释倍数),ΔA=A测定-A对照。

B-AI活性计算:

标准条件下测定的回归方程为 y = 0.0016x -0.001;x为标准品浓度(μg/mL),y为吸光值。

(1)按蛋白浓度计算:

单位的定义:37℃每 mg蛋白每分钟产生 1μg还原糖定义为一个酶活性单位。

B-AI活性(μg/min/mg prot)=[(ΔA +0.001)÷0.0016×V1]÷(V1×Cpr )÷T=20.8×(ΔA +0.001)÷Cpr

(2)按鲜重计算:

单位的定义:37℃每 g组织每分钟产生 1μg还原糖定义为一个酶活性单位。

B-AI活性(μg/min/g鲜重)=[(ΔA +0.001)÷0.0016×V1]÷(W ×V1÷V2)÷T =20.8×(ΔA +0.001)÷W

V1:加入反应体系中样本体积,0.2mL;V2:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,30min; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本鲜重,g。

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