检测目的

用于定量检测小鼠血清、血浆、细胞上清液等样本中IL-4的浓度。

实验原理

（双抗体夹心法）

包被抗体：抗小鼠IL-4单克隆抗体预包被于微孔板。

样本结合：加入样本，样本中IL-4与固相抗体结合。

检测抗体：加入HRP标记的抗小鼠IL-4二抗，形成“抗体-抗原-酶标抗体”复合物。

显色反应：

加入底物TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺），HRP催化TMB生成蓝色产物。

加入终止液（酸性溶液）后转为黄色。

结果读取：在450nm波长下测定吸光度（OD值），OD值与IL-4浓度正相关。

试剂盒组成

| 组件 | 规格（96孔） | 保存条件 |

| 预包被微孔板 | 12条×8孔 | 2–8°C |

| IL-4标准品 | 冻干粉/溶液 | -20°C |

| HRP标记检测抗体 | 1瓶（120μL） | 2–8°C |

| TMB底物溶液 | 1瓶（10mL） | 避光2–8°C |

| 终止液（2M H₂SO₄） | 1瓶（10mL） | 2–8°C |

| 浓缩洗涤缓冲液 | 1瓶（50mL） | 2–8°C（按需稀释） |

| 封板膜 | 2张 | 室温 |

注：实际组分请以厂商**说明书为准，浓缩洗涤液需按说明书比例稀释（如1:25）。

样本要求

血清/血浆：避免溶血，离心去除颗粒物，-80°C长期保存。

细胞上清液：离心去除细胞碎片，避免反复冻融。

操作步骤

标准品稀释：用标准品稀释液配制系列浓度梯度（如0–500 pg/mL）。

加样：

标准孔：50μL 标准品

样本孔：50μL 样本

孵育：37°C孵育1–2小时。

洗涤：甩干孔内液体，用洗涤液注满微孔，静置30秒后弃去，重复5次。

加酶标抗体：每孔加100μL HRP标记抗体，37°C孵育1小时。

洗涤：同上，重复5次。

显色：每孔加90μL TMB，避光反应15–30分钟。

终止：每孔加50μL终止液，颜色由蓝转黄。

检测：30分钟内于450nm读取OD值（校正波长：570nm或630nm）。

结果计算

绘制标准曲线：以标准品浓度（log）为横坐标，OD值（log）为纵坐标。

根据样本OD值，通过曲线方程计算IL-4浓度（单位：pg/mL）。

注意事项

试剂平衡：所有组分使用前室温平衡30分钟。

洗涤彻底：避免假阳性，每次洗涤后拍干孔板。

显色控制：TMB反应时间需优化，避免过度显色。

安全防护：终止液含强酸，需穿戴手套操作。

参考范围与性能参数

灵敏度：通常<10 pg/mL。

精密度：批内CV <10%，批间CV <15%。

特异性：不与小鼠IL-2、IL-6等其他细胞因子交叉反应。

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