检测原理

采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）：

包被抗人αENOL单克隆抗体于微孔板；

加入样本/标准品，αENOL与包被抗体结合；

加入生物素标记的检测抗体，形成“抗体-抗原-抗体”复合物；

加入链霉亲和素-HRP（辣根过氧化物酶）；

加入TMB底物显色，颜色深度与αENOL浓度成正比。

试剂盒组分

| 组分 | 规格（96T） | 保存条件 |

| 预包被微孔板 | 96孔 | 2-8℃（干燥） |

| αENOL标准品 | 6-8个浓度点 | -20℃或-80℃ |

| 样本稀释液 | 15-30mL | 2-8℃ |

| 生物素标记检测抗体 | 1瓶（120μL）| -20℃（避光） |

| 链霉亲和素-HRP结合物 | 1瓶（120μL）| 2-8℃（避光） |

| TMB显色底物 | 1瓶（10mL） | 2-8℃（避光） |

| 终止液（2M H₂SO₄） | 1瓶（10mL） | 室温 |

| 洗涤缓冲液（20×浓缩液） | 1瓶（50mL） | 室温 |

样本要求

适用样本：血清、血浆（EDTA/肝素抗凝）、细胞上清液、组织匀浆液。

处理建议：

血清/血浆：离心去除颗粒物，避免反复冻融（分装保存于-80℃）；

细胞上清：离心去除沉淀；

组织样本：裂解后离心取上清，总蛋白浓度建议1-2 mg/mL。

操作步骤

稀释：标准品梯度稀释，样本按说明书比例用稀释液预处理（典型稀释倍数：血清1:100）。

加样：每孔100μL标准品/样本，37℃孵育90分钟。

洗涤：弃液后PBST洗涤3次（自动洗板机推荐）。

加检测抗体：每孔100μL生物素化抗体，37℃孵育60分钟。

加酶结合物：每孔100μL SA-HRP，37℃避光孵育30分钟。

显色：每孔90μL TMB，室温避光显色10-20分钟（蓝色）。

终止：每孔50μL终止液（变黄色）。

读值：450nm波长测量OD值（参考波长630nm）。

结果计算

标准曲线绘制（浓度 vs OD值）：

[典型标准品浓度]：0, 15.6, 31.2, 62.5, 125, 250, 500, 1000 pg/mL  

四参数拟合（4-PL）或对数坐标回归曲线。

样本浓度 = 曲线计算值 × 稀释倍数。

关键性能参数

| 指标 | 典型值 |

| 检测范围 | 15.6 - 1000 pg/mL |

| 灵敏度（最低检出限）| ≤5 pg/mL |

| 精密度（CV%） | 板内<8%，板间<10% |

| 特异性 | 无交叉反应（如β-enolase）|

| 回收率 | 85%-115%（样本添加实验）|

注意事项

试剂使用前平衡至室温（显色液避光）；

终止液具腐蚀性，需防护；

显色时间需优化，避免过度反应；

浓度超范围需稀释后重测；

避免试剂污染（尤其是酶/底物）。

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