产品及特点

隐孢子虫(Cryptosporidium)为体积微小的球虫类寄生虫，广泛存在多种脊椎动物体内，寄生于人和大多数哺乳动物的主要为微小隐孢子虫(C. parvum)，引起隐孢子虫病(cryptosporidiosis)，是一种以腹泻为主要临床表现的人畜共患性原虫病，因此对隐孢子虫进行快速灵敏的诊断具有重要的意义。本产品就是根据隐孢子虫 rRNA编码基因的保守区设计引物而开发的高灵敏荧光定量 PCR产品。本试剂盒具有下列特点：

1、根据隐孢子虫 OWP(oocyst wall protein)编码基因保守序列设计的专一性引物，与其他肠道疾病病原体(如B.hominis、E.coli、E.dispar、E.moshkovskii、 V.cholerae等)无交叉反应。

2、灵敏度比常规 PCR高 2-3个数量级，可以达到几十拷贝/反应。

3、即开即用，用户只需要提供样品模板，操作简单，定量准确快速。

4、一管式荧光定量 PCR检测，避免后续污染。

5、本试剂盒足够 100次 20uL反应体系的荧光定量 PCR。

6、本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

规格及成分

运输及保存

低温运输、-20℃保存(A袋试剂放样品准备区、C袋的阳性对照**分开放置)，有效期一年。

自备试剂

DNA模板、10×ROX(根据机型决定，具体见使用方法)。

使用方法

一、样品 DNA的制备

1、用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数原虫 DNA提取试剂盒兼容。本公司的柱式粪便 DNA提取试剂盒也可以用于隐孢子虫 DNA提取。

二、引物的制备(在样品制备室进行)

2、按引物标签提示在装引物干粉的管中直接加入适量的超纯水(加入量见引物试管上的标签)，使得两条引物的浓度均为 10μM(10pmol/μL)，然后各取 110μL混合在一起得 220μL，标注为引物混合物，放冰上待用。220μL足够 100次 qPCR反应。

三、稀释阳性对照(以 10²-10⁷这 6个 10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的长为 150bp的 DNA片段作为阳性对照。

3、标记 6个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

4、用带芯枪头分别加入 45 μL超纯水(**用带芯枪头，下同)。

5、在 7号管中加入 5 μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照，充分震荡 1分钟，得1×10⁷拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

6、换枪头，在 6号管中加入 5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

7、换枪头，从 6号管中取 5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照到 5号管中，充分震荡 1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

8、换枪头，从 5号管中取 5 μL 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照到 4号管中，得1×10⁴拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

9、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

四、设置 qPCR反应(20 μL体系，在样品制备室进行)

10、在 PCR管中加入下列成分(待测样品需要做三次重复，下表只列出一次。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

注:仅 ABI7500、7700和 7900仪器需要使用 ROX作为对照，其他荧光 PCR仪器(如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和 LightCycler480)不需要使用 ROX。

11、盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR(具体 PCR参数可以根据仪器不同而自行优化)。

12、数据采集

具体操作按所用仪器推荐的流程进行。一般在复性步骤采集荧光数据。本产品中所含的荧光染料在不结合 DNA时，最大吸收光谱在 471 nm，结合 DNA时的最大吸收光谱在 500 nm，最大发射光谱在 530 nm。

五、数据处理

13、以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 DNA浓度的 log值，再推算出其浓度。