注意：正式实验之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

蛋白质羰基是多种氨基酸在蛋白质的氧化修饰过程中的早期标志，其含量高低表明蛋白质氧化损伤程度的大小，是衡量蛋白质氧化损伤的主要指标。

测定原理：

羰基与 2,4-二硝基苯肼反应生成红色 2,4-二硝基苯腙，在 370nm 处有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器：

天平、恒温水浴锅、低温离心机、漩涡震荡仪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、蒸馏水、无水乙醇、乙酸乙酯。

试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：粉剂 0.1g×6 支，4℃避光保存。(使用前根据样品数，每支加 1mL 水溶解，每支为10 个样品用量)

试剂二：液体 8mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂三：液体 8mL×1 瓶，4℃保存。

试剂四：液体 18mL×1 瓶，4℃保存。

试剂五：根据测定样品量，将乙酸乙酯和无水乙醇等体积混合。

试剂六：液体 35mL×1 瓶，4℃保存。

样品处理：

1. 组织样品：按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5～10  的比例(建议称取约 0.1g组织，加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆，于 4℃，4000g 离心 10min，取上清，加入 0.1mL试剂一，室温放置 10min，4℃，10000g 离心 10min，取上清待测。

2.细菌、真菌：按照细胞数量(104 个)：提取液体积(mL)为 500～1000：1  的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 提取液)，冰浴超声波破碎细胞(功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min)；然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

3.血清等液体样本：直接测定。

测定步骤和操作表：

1、 分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长至 370nm。

2、操作表

计算公式：

a．用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1.按照样本蛋白浓度计算

蛋白质羰基含量(μmol/mg prot)= [ΔA370×V 反总÷(ε×d)]÷(V 样×Cpr) =0.227×ΔA370÷Cpr

2.按照样本重量计算

蛋白质羰基含量(μmol/g 鲜重)= [ΔA370×V 反总÷(ε×d)]÷(W ×V 样÷V 样总) =0.227×ΔA370÷W

3.  按照细胞数量计算

蛋白质羰基含量(μmol/10⁴cell)=  [ΔA370×V  反总÷(ε×d)]÷(细胞数量 ×V 样÷V 样总)=0.227×ΔA370÷细胞数量

4.按照液体体积计算

蛋白质羰基含量(μmol/mL)= [ΔA370×V 反总÷(ε×d)]÷V 样=0.227×ΔA370

V 反总：反应体系总体积，0.3 mL；ε：羰基毫摩尔消光系数，22 L/mmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.06 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，W：样本质量，g

b．用 96 孔板测定的计算公式如下

1.按照样本蛋白浓度计算

蛋白质羰基含量(μmol/mg prot)= [ΔA370×V 反总÷(ε×d)]÷(V 样×Cpr) =0.454×ΔA370÷Cpr

2.按照样本重量计算

蛋白质羰基含量(μmol/g  鲜重)= [ΔA370×V 反总÷(ε×d)]÷(W ×V 样÷V 样总) =0.454×ΔA370÷W

3.按照细胞数量计算

蛋白质羰基含量(μmol/10⁴cell)= [ΔA370×V 反总÷(ε×d)]÷(细胞数量 ×V  样÷V 样总)=0.454×ΔA370÷细胞数量

4.  按照液体体积计算

蛋白质羰基含量(μmol/mL)= [ΔA370×V 反总÷(ε×d)]÷V 样=0.454×ΔA370

V 反总：反应体系总体积，0.3 mL；ε：羰基毫摩尔消光系数，22 L/mmol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.06 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，W：样本质量，g

注意事项：

1.试剂一使用前根据要测定的样品数现配，配置好后 4℃保存，若变为黑色，则不能使用。

2.试剂二见光易分解，反应需严格避光。