SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX)
注意事项
- SYBR Green Master Mix (High ROX) 在 -80℃ 存放可能会产生白色或淡黄的沉淀，可用手握缓慢溶解，于室温短时间避光放置，轻柔上下颠倒混匀直至沉淀全部消失。不影响试剂性能。
- 使用前，请上下轻轻颠倒混匀，避免产生气泡，然后进行短暂的离心，防止因混合不均匀造成反应效果不佳。
- 避免反复冻融，防止聚合酶活性下降，可将产品分装保存，以便小剂量的多次使用。
- 由于SYBR Green I荧光染料随着时间的推移可能会在光照下褪色，从而导致敏感性下降，因此在存储和使用过程中要避免强光照射。
- 由于qPCR反应的高灵敏度，空气或气溶胶的污染可能导致反应失败或结果不准确。因此请使用无菌的针尖、灭菌过的试管和移液管在清洁的环境中进行qPCR反应
- 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作，再配置反应体系或者分装时请一定使用新(无污染)枪头、Microtube 等，避免污染。
- 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
结果分析
- 定量实验至少需要三个生物学重复。反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线。
- 扩增曲线：一般CT值的正常范围为15-35之间，其中20-28之间的定量较为准确。如果CT值过小，则需重新稀释模板；如果CT值过大，则需适当提高模板浓度、提高引物浓度以及调试最佳QPCR程序。
- 溶解曲线：通常只有溶解曲线为单峰时，才为有效定量结果。如果溶解曲线出现多峰，则需优化条件重新实验，常见方法通常需要重新设计引物等。
保存条件
- -20℃避光储存，有效期20个月。
- 请尽量避免反复冻融，如需频繁使用请先提前分装保存。
- 产品中含有荧光染料SYBR Green I，保存或配制反应体系时需避免强光照射。
反应体系(以50 μL和20 μL为例，推荐冰上配制)
| 组分 | 体积（μl） | 体积（μl） | 终浓度 |
|---|
| qPCR SYBR Green Master Mix (High ROX) | 25 | 10 | 1× |
| Forward Primer (10μM) | 1 | 0.4 | 0.2μM |
| Reverse Primer (10μM) | 1 | 0.4 | 0.2μM |
| 模板DNA | X | X |
| 无菌超纯水 | to 50 | to 20 |
| 总反应体系 | 50 | 20 |
【注】：使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。
a) 引物浓度：通常引物终浓度为0.2μM，也可以根据情况在0.1-1.0μM之间进行调整。
b) 模板浓度：如模板类型为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。
c) 模板稀释：cDNA原液建议5-10倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的CT值在20-30个循环为好。
d) 反应体系：推荐使用20μl或50μl，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
e) 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。
扩增程序（两步法）
| 循环步骤 | 温度 | 时间 | ** 循环数** |
|---|
| 预变性 | 95 °C | 5 min | 1 |
| 变性 | 95 °C | 10 sec | 40 |
| 退火/延伸 | 60 °C | 30 sec ★ | 40 |
| 溶解曲线阶段 | 仪器默认设置 | | 1 |
扩增程序（三步法）
| 循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
|---|
| 预变性 | 95 °C | 5 min | 1 |
| 变性 | 95 °C | 10 sec | 40 |
| 退火 | 55-60 °C | 20 sec | 40 |
| 延伸 | 72 °C | 20 sec ★ | 40 |
| 溶解曲线阶段 | 仪器默认设置 | | 1 |
【注】高特异性可选择两步法，高效率扩增可选择三步法。
a) 预变性时间：根据不同模板和引物的具体情况可适当缩短至2min。
b) 退火温度和时间：请根据引物和目的基因的长度进行调整。
c) 荧光信号采集（★）：请按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置，几种常见仪器的时间设定如下：
30 sec以上：Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus,7500 Fast；Roche Applied Science: LightCycler 480；Bio-Rad: CFX96
31 sec以上：Applied Biosystems: 7300
34 sec以上：Applied Biosystems: 7500
d) 熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。
适用机型
本品内含 High ROX Reference Dye，适用于需要校正孔间荧光信号误差的仪器，适用机型如下：
Applied Biosystems 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT Fast; StepOne, StepOne Plus.
产品应用
- 基于荧光定量PCR检测
- 核酸扩增和基因表达
- 自动化和高通量的定量基因分型研究
- 基因组学相关应用
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