Cell Counting Kit-8 (CCK-8;CCK8)

检测实验原理

  与MTT检测相比，Cell Counting Kit-8（CCK-8）为细胞数测定和细胞增殖/毒性测定的研究提供了更方便和灵敏的方法。其使用了一种高水溶性的四唑盐WST-8 [2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium,monosodiu m salt]，它在电子耦合试剂存在下还原产生水溶性 formazan 形式的染料。

  我们的产品CCK-8已经与电子耦合试剂混合，是即用型。WST-8可被活细胞中丰富的脱氢酶还原，转化为formazan形式，这是一种可溶于培养基的橙色染料（如下图）。脱氢酶产生的 formazan的量与活细胞的数量呈直接的线性关系。

功能属性

应用: 

(1)细胞增殖测定- CCK-8是水溶性的，在培养中是稳定的，并且是无毒的。

(2)细胞活力测定-代谢活性和染料产生与改变的活力成比例地变化。

(3)细胞因子测定-测量细胞因子诱导的增殖。如果需要，可以在研究结束时回收细胞并扩增。

(4)细胞毒性测定-来自细胞毒性化学物质的细胞死亡对颜色发展没有影响，只有活细胞将试剂转化为比色指示剂。试剂本身具有可忽略的毒性，并且通常对细胞是安全的。 

储存条件:储存在4°C避光，可稳定长达12个月。储存在-20°C避光，可稳定长达2年。

实验参考方法

需要的的设备和材料 

酶标仪 (450nm 滤光片) 

96孔板 

10ul, 100-200ul 多通道移液器 

细胞CO2培养箱

细胞活性检测实验

1.将细胞悬浮液（100uL/孔）接种在96洞孔板中。将板在潮湿的培养箱中预孵育（例如，在37℃，5％CO2下）。
2.向板的每个孔中加入10uL CCK8溶液。注意不要在孔洞中引入气泡，因为它们会干扰O.D.值检测。
3.将培养板在培养箱中孵育1-4小时。
4.使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。

细胞增殖/细胞毒性测定实验
1.将种子细胞以10³-10⁴个细胞/孔的密度在96孔板中在100uL培养基中培养。将板在潮湿的培养箱中预培养24小时（例如，在 37℃，5％CO2下）。
2.将10uL不同浓度的待测物质加入板中。
3.将培养板在培养箱中孵育适当的时间（例如，6,12,24或48小时）。
4.使用移液器向板的每个孔中加入10uL CCK8溶液。注意不要在孔洞中引入气泡，因为它们会干扰O.D.值检测。
5.将培养板在培养箱中孵育1-4小时。
6.在读取平板之前，可以在摇床上温柔的混匀，以确保颜色均匀分布,再使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。

数据分析
统计分析有几种方法，您可以选择使用O.D.值或细胞数量，我们提供其中一种方法。
细胞存活率（％）= [（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100
抑制率（％）= [（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100
As =实验孔吸光度（含有细胞，培养基，CCK-8和待测化合物的孔的吸光度）。
Ab =空白孔吸光度（含有培养基和CCK-8的孔的吸光度）。
Ac =对照孔吸光度（含有细胞，培养基和CCK-8的孔的吸光度）。

制作标准曲线
1. 细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数。
2. 使用培养基，等比稀释细胞悬液为一个浓度梯度，通常需要5-7个浓度梯度，每组几个复孔。然后接种细胞。（注意每孔的细胞数量。如果您将细胞悬液稀释在管中，在加入培养板的孔之前，请小心再次混匀细胞。每孔中细胞悬液的体积应该是一致的。）
3. 培养直至细胞贴壁（通常2-4小时），然后每100ul 培养基加入10ul CCK-8。继续孵育1-4小时，用酶标仪测量450nm处的吸光度。制作出一条以细胞数为X轴坐标，O.D.值为Y轴坐标的标准曲线。
可以基于该曲线确定待测样品的细胞数。使用此标准曲线的先决条件是培养检测条件相同。

注意事项

1. 确保药物和CCK8均匀分布在培养基中。
2. 细胞增殖越多, 颜色越深; 细胞毒性越强，颜色越浅。
3. 对于贴壁细胞，每孔至少需要1000个细胞（100 μl培养基）。对于白细胞，由于灵敏度较低，每孔至少需要2500个细胞（100 μl培养基）。推荐的96孔板每孔最大细胞数为25000。如果使用24孔或6孔板进行该检测，请计算相应的每孔的细胞数，并调整CCK-8的体积，使其为每孔总液体体积的10％。
4. 因为CCK8测定是基于活细胞中的脱氢酶活性，影响脱氢酶活性的条件或化学物质可能导致实际活细胞数与使用CCK-8测定活细胞数之间有差异。
5. WST-8可能与还原剂反应生成WST-8 formazan。如果使用还原剂 (例如一些抗氧化剂)会干扰检测。如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。
6. 孵育2小时后，背景O.D.值一般为0.1-0.2单位。
7. 注意不要在孔中引入气泡，因为它们会干扰O.D.值。
8. 如果您想对CCK8溶液进行灭菌，请使用0.2 μm的膜过滤溶液。
9. 孵育时间因孔中细胞的类型和数量而异。通常，白细胞着色较弱，因此可能需要较长的孵育时间（长达4小时）或大量细胞（~105细胞/孔）。
10. 如果细胞悬液中存在高浊度, 测量并减去样品在600nm或更高波长的O.D值。
11. CCK8不能用于细胞染色。
12. 培养基中的酚红不会影响实验结果，酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。
13. CCK8的毒性非常低，在CCK8测定完成后，相同的细胞可用于其他细胞增殖测定，例如结晶紫测定，中性红测定或DNA荧光测定。（除非细胞极为稀少，不推荐。）
14. 该试剂盒可用于大肠杆菌，但不能用于酵母细胞。
15. 在读取平板之前，您可以在摇床上轻柔混匀。
16. 我们建议将细胞接种在靠近培养板中央的孔中，最外围一圈孔中的培养基容易蒸发，可以用PBS，水或培养基填充这些孔。
17. 如果您没有450nm滤光片。您也可以使用吸光度在430和490nm之间的滤光片, 450nm滤光片具有最佳灵敏度。
18. 测量450nm处的吸光度，如果您需要进行双波长测定，作为参考波长可以测定650nm处的吸光度。
19. 药物中金属离子的存在可能会影响CCK8的灵敏度。终浓度为1mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制 5%、15%、 90% 的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是10mM的话，将会100%抑制。