描述

HyperScript(TM) RT SuperMix for qPCR (with gDNA wiper)是基于HyperScript(TM) Reverse Transcriptase（货号K1071）的逆转录反应预混液。HyperScript(TM) Reverse Transcriptase是在M-MLV (RNase H-) Reverse Transcriptase基础上经过基因工程改造后获得的全新逆转录酶，相较而言HyperScript(TM) Reverse Transcriptase降低了RNase H活性且大幅度提高了热稳定性。HyperScript(TM) Reverse Transcriptase可耐受更高的反应温度，适用于具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。

HyperScript(TM) RT SuperMix for qPCR (with gDNA wiper)适用于两步法qRT-PCR检测，5×SuperMix中含有逆转录所需的所有成分，加入模板RNA和RNase Free ddH₂O就可以迅速进行反应。产品中包含的4×gDNA wiper可在逆转录前快速彻底去除体系中潜在的基因组干扰。该试剂盒非常适合于低浓度RNA模板的逆转录反应。5×SuperMix在-20°C不会冻结，使用方便。

本产品针对qPCR进行特别优化，经过比例优化的Oligo (dT)₂₃VN primer mix/Random primers，使cDNA合成可从RNA转录本的各个区域起始并具有相同的逆转录效率，最大程度保证了qPCR结果的真实性和可重复性。逆转录产物适用于SYBR Green和探针法qPCR，可以根据实验目的，选择相应的试剂配合使用，进行高性能的基因表达分析。

组份和存储

特性

5X RT SuperMix中含有逆转录所需的所有成分，方便操作；

经过优化的Oligo (dT)₂₃VN引物与随机引物比例可最大程度保证qPCR结果的真实性和可重复性；

基于高效的HyperScript(TM) Reverse Transcriptase，适用于具有二级结构的RNA 模板；

可检测低至1 pg的模板起始量；

提供的Oligo (dT)₂₃VN引物比Oligo (dT)₁₈对模板锚定能力更强，逆转录效率更高。

常见问题解答

1）Q：收到产品后应怎么保存？

A：所有组分-20°C保存，有效期至少1年。

2）Q：能否通过延长逆转录时间来提高逆转录效率？

A：对于大多数基因，延长逆转录时间对逆转录效率并没有明显的提升；但对于一些GC含量较高或含高级复杂结构的模板，延长逆转录时间可提升逆转录效率。

3）Q：可以通过测逆转录产物cDNA的浓度来判定逆转录的效率吗？

A：不可以。因为逆转录产物除了cDNA外，还有buffer、逆转录酶、引物、未转录的模板RNA等，这些都会干扰cDNA浓度测定结果，因此不能反应真实的cDNA产量。

4）Q：逆转录产物用PCR扩增后跑胶检测无特异性条带？

A：可能原因及解决方案如下：

a. 模板RNA发生了降解：哺乳动物细胞或组织的总RNA琼脂糖电泳后应该可以看到清晰的18S和28S rRNA条带，并且28S rRNA和18S rRNA的亮度比例应该大于等于2.0，如果比例小于2.0，则说明总RNA发生了显著的降解，需重新制备模板。

b. 模板RNA的纯度偏低：在提取纯化RNA的过程中，残留在溶液中的一些成分如苯酚、SDS、EDTA等会抑制逆转录酶活性。可对RNA样品进行柱纯化，或者进行沉淀、洗涤和再溶解，通常可以有效去除残留的污染物。

c. 逆转录模板量不足：在抽提获得总RNA后，在进行一些精细的定量检测时通常会进行DNase I消化，以充分去除可能的残留的DNA的干扰。DNase I进行热失活时，需要加入EDTA至终浓度为2.5mM，否则RNA在没有螯合剂的情况下，在加热过程中容易被水解，从而导致模板量不足。此外，扩增特定基因时，需要先查询该基因的组织分布特点，利用其高表达的组织进行目的基因的反转录和克隆。

d. RNA模板富含GC或容易形成二级结构：可考虑把反转录温度提高到45-55°C。