酶活性分析

构建含人JAK2激酶结构域（840 ~ 1132位氨基酸）的质粒pAcG2TtevJAK2。分别构建JAK3 (813 ~ 1124)、TYK2 (888 ~ 1187) 和JAK1 (866 ~ 1154) 质粒。根据产品手册 (BD Biosciences Pharmingen) 构建含BD BaculoGoldTM Bright线性DNA的融合杆状病毒，进行空斑实验和单一斑块病毒扩增实验。在27°C下，用100 mL加了Penicillin/Streptomycin溶液的ExCell420培养基 (JRH Biosciences Ltd)培养Sf9细胞48小时，使其表达Janus激酶结构域。在悬浮培养细胞的浓度为1 × 106时，进行感染。用可溶性蛋白的产量优化每个病毒的感染复数(MOI)。在MOI分别为1和0.5时，细胞表达人JAK2、JAK1、JAK3和TYK2激酶结构域。在27°C下，细胞于48小时后表达JAK2，于48或72小时表达JAK1、JAK3和TYK2。感染后48小时或72小时后，将100 mL表达培养液离心5分钟（3000 × g），收集细胞。在4°C下，用12 mL裂解缓冲液裂解细胞30分钟，缓冲液成分为50 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，2 mM EDTA，1 mM DTT，1 mM原钒酸钠，1 % Triton X-100，10 % 甘油，1 × 不含EDTA的蛋白酶完全抑制剂混合物 (Roche Diagnostics) 和12.5 U/mL Benzonase。14,000 × g离心45分钟，分离颗粒性不可溶物质。在4°C下，利用GST标记的亲和性纯化蛋白激酶结构域。将之前离心所得的上清与0.2 mL含50 % Glutathione Sepharose 4B的悬浮液置于4°C下孵育2小时，然后用1 mL含50 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，0.1 % Triton X-100，1 mM DTT和10 %甘油的缓冲液洗5次。用0.25 mL的洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，0.1 % Triton X-100，1 mM DTT, 10%甘油，10 mM还原性L-谷胱甘肽）洗脱结合到胶上的蛋白，分5次洗脱，每次孵育10分钟。用Amicon Ultra-4离心超滤管浓缩洗脱液至1/5的体积。加入Brij35至其终浓度为0.1%，将蛋白分成小份，置于-80℃速冻保存。在上述储存条件下，其激酶活性能保持至少6个月。在含0.1 μM [γ33P]-ATP，1 mM MnCl2，5 mM MgCl2，30 μM合成多肽底物EQEDEPEGDYFEWLE，1 mM DTT，1 % DMSO，50 μg/mL BSA，0.01% Brij35和50 mM Tris-HCl pH 7.5的缓冲体系中，加入JAK激酶结构域，室温孵育30分钟。对于所有蛋白，ATP的浓度均低于其Km值。用XLfit? （型号205）的全局拟合功能以及逻辑斯谛方程对曲线进行非线性回归拟合。其它地方已介绍了全长野生型JAK2及其突变体V617F的表达与鉴定和激酶实验条件。NVP-BSK805的激酶选择性实验如下：在Caliper实验中，当多肽底物被磷酸化后，多肽底物在电场中会有不同的迁移速度，以此来检测激酶反应。由于多肽带有荧光标记，在毛细管系统中可以检测及定量多肽。用LC3000仪器 (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA) 对多肽的荧光进行定量。在激酶实验中，激酶的活性可以通过检测剩余的ATP数量来定量。在LanthaScreen? TR-FRET激酶实验中，铽元素作为镧系元素螯合物，结合抗磷酸化底物的抗体。

细胞系

Ba/F3细胞

制备方法

溶于DMSO。若配制更高浓度的溶液，一般步骤如下：请将试管置于37℃加热10分钟和/或将其置于超声波浴中震荡一段时间。原液于-20℃可放置数月。

反应条件

100 nM；72小时

实验结果

NVP-BSK805抑制JAK2V617F细胞 (Ba/F3) 生长，而且诱导细胞凋亡，其GI50在< 100 nM的浓度。

动物模型

rhEpo诱导的红血球增多症雌性BALB/c小鼠

给药剂量

50、75和100 mg/kg；口服给药；每日1次

实验结果

给予BALB/c小鼠25、50和100 mg/kg NVP-BSK805能抑制rhEpo诱导的STAT5磷酸化以及rhEpo介导的红细胞增多和脾肿大。

其它注意事项

请于室内测试所有化合物的溶解度。虽然化合物的实际溶解度可能与其理论值略有不同，但仍处于实验系统误差的允许范围内。

References:

[1]. Baffert F, Régnier CH, De Pover A, et al. Potent and selective inhibition of polycythemia by the quinoxaline JAK2 inhibitor NVP-BSK805. Mol Cancer Ther, 2010, 9(7): 1945-1955.