DiD is a long-chain carbocyanine dye. Carbocyanine dyes are widely used as Di to label cells, organelles, liposomes, viruses and lipoproteins^[2].

制备 Di 染色溶液
1.1 制备 DMF、DMSO 或乙醇储备溶液：储备溶液应在 1-5 mM 的二甲基甲酰胺 (DMF) 、二甲基亚砜 (DMSO 或乙醇 DMSO 中制备。DMF 比乙醇更适合作为 Di 的溶剂。储备溶液应及时使用。任何未使用的溶液可作分装储存在 -20℃。避免反复冻融，溶液可储存 6 个月。
1.2 制备工作溶液：将储备溶液稀释到合适的缓冲液中，如无血清培养基、HBS 或 PBS，以制备 1-5 μM工作溶液，现配现用。
注：应根据经验确定不同实验条件下工作溶液的最终浓度。
2. 悬浮细胞
2.1 悬浮细胞：离心收集细胞，加入 PBS 洗涤两次，每次 5 分钟。细胞密度在 1×10⁶/mL
2.2 加入 1 mL Di 工作液，室温孵育 5-30 分钟。
2.3 400 g，4℃ 离心 3-4 分钟，弃去上清。
2.4 加入 PBS 洗涤细胞两次，每次 5 分钟。
2.5 用 1 mL 无血清培养基或 PBS 重悬细胞后，使用荧光显微镜或流式细胞仪进行观察。
3. 贴壁细胞
3.1 将贴壁细胞培养于无菌盖玻片上。
3.2 从培养基中移出盖玻片，吸除多余培养基。
3.3 加入 100 μL 染料工作液，轻轻晃动使其完全覆盖细胞，孵育 5-30 分钟。
3.4 吸去染料工作液，用培养基洗 2-3 次，每次 5 分钟，使用荧光显微镜或流式细胞仪进行观察。

Two weeks after injection of stained cells, a single, bright, DiD perchlorate (DiD)-positive cells located between 15 to 40 μm from the endosteum is found. Results reveal a progressive appearance of cell clusters of decreased dye intensity, consistent with the partitioning of DiD perchlorate label on cell division^[3].

959.90

Solid

C₆₁H₉₉ClN₂O₄

127274-91-3

Room temperature in continental US; may vary elsewhere.

4°C, protect from light, stored under nitrogen

*该产品在溶液状态不稳定，建议您现用现配，即刻使用。

DMSO : 25 mg/mL(26.04 mM;ultrasonic and warming and heat to 60℃)

请根据产品在不同溶剂中的溶解度，选择合适的溶剂配制储备液；该产品在溶液状态不稳定，建议您现用现配，即刻使用。

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解方案。以下溶解方案都请先按照In Vitro方式配制澄清的储备液，再依次添加助溶剂：

——为保证实验结果的可靠性，澄清的储备液可以根据储存条件，适当保存；体内实验的工作液，建议您现用现配，当天使用； 以下溶剂前显示的百
分比是指该溶剂在您配制终溶液中的体积占比；如在配制过程中出现沉淀、析出现象，可以通过加热和/或超声的方式助溶

• 1.

  请依序添加每种溶剂： 10% DMSO    40%PEG300   5%Tween-80   45% saline

  Solubility: ≥ 1.67 mg/mL (1.74 mM); Clear solution

  此方案可获得 ≥ 1.67 mg/mL (1.74 mM，饱和度未知) 的澄清溶液。

  以 1 mL 工作液为例，取 100 μL 16.7 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀；然后继续加入 450 μL生理盐水定容至 1 mL。

  将 0.9 g 氯化钠，完全溶解于 100 mL ddH2O 中，得到澄清透明的生理盐水溶液
• 2.

  请依序添加每种溶剂： 10% DMSO    90% (20%SBE-β-CDin saline)

  Solubility: ≥ 1.67 mg/mL (1.74 mM); Clear solution

  此方案可获得 ≥ 1.67 mg/mL (1.74 mM，饱和度未知) 的澄清溶液。

  以 1 mL 工作液为例，取 100 μL 16.7 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 900 μL20% 的 SBE-β-CD 生理盐水水溶液中，混合均匀。

  将 2 g 磺丁基醚 β-环糊精加入 5 mL 生理盐水中，再用生理盐水定容至 10 mL，完全溶解，澄清透明
• 3.

  请依序添加每种溶剂： 10% DMSO    90%corn oil

  Solubility: ≥ 1.67 mg/mL (1.74 mM); Clear solution

  此方案可获得 ≥ 1.67 mg/mL (1.74 mM，饱和度未知) 的澄清溶液，此方案不适用于实验周期在半个月以上的实验。

  以 1 mL 工作液为例，取 100 μL 16.7 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 900 μL玉米油中，混合均匀。

• 
  Description: DiD perchlorate is a far-red fluorescent lipophilic cyanine dye, it can be used in intravital imaging.
  Method: For extracellular vesicle (EVs) staining.
  1. Purified extracellular vesicles suspended in PBS and incubate with DiD perchlorate (1 μM; 15 min), and by an additional wash to remove the free dye.
  2. DiD perchlorate-labeled EVs are resuspended in PBS and injected intravenously into 6-week-old female hACE2 mice (C57BL/6) with 150 μg EV per mice.
  3. The hACE2 mice are sacrificed at 24 h, 48 h,72 h and 96 h post injection.
  4. The red fluorescence of the whole body is acquired by IVIS spectrum (Caliper Life Sciences).