测定原理:
利用80%乙醇可以把样品中可溶性糖与淀粉分开,利用双波长比色法测定支链淀粉含量。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1ml 玻璃比色皿、研钵、冰、乙醚和蒸馏水。
试剂的组成和配制(50T/48样):
试剂一:液体50ml×1 瓶;4°C保存;
试剂二:乙醚50ml×1 瓶;(自备)
试剂三:液体50ml×1 瓶;4°C保存;
试剂四:液体4ml×1 瓶; 4°C保存;
试剂五:液体1ml×1 瓶;4°C保存;
淀粉提取:
称取0.01~0.02g 烘干样本(建议称取约0.01g)于研钵中研碎,加入1ml 试剂一,充分匀浆后转移到EP 管中,80°C水浴提取30min,3000g,25°C离心5min,弃上清,留沉淀,加入1ml 试剂二(乙醚)振荡混匀5min,3000g,25°C离心5min,弃上清,留沉淀,加入1ml 试剂三充分溶解,90°C水浴10min,冷却后待测。
测定步骤:
测定管:在EP 管中依次加入100μl样本,70μl试剂四,600μl蒸馏水,10μl试剂五,220μl 蒸馏水,混匀,分别测定550nm和743nm 处吸光值,△A测定=A550-A743。
空白管:在EP 管中依次加入100μl试剂三,70μl试剂四,600μl蒸馏水,10μl试剂五,220μl 蒸馏水,混匀,分别测定550nm和743nm 处吸光值,△A空白=A550-A743。
支链淀粉含量计算:
标准条件下测定的回归方程为y=0.1214x+0.0076;x 为标准品浓度(mg/ml),y 为吸光值。
1、按照蛋白浓度计算
支链淀粉含量(mg/mgprot)=[( △A测定-△A空白-0.0076)×V1]÷0.1214 ÷(V1×Cpr)
=8.24×(△A测定-△A空白-0.0076) ÷Cpr
2、按样本干重计算
支链淀粉含量(mg/g干重)= [(△A测定-△A空白-0.0076)×V1] ÷0.1214÷(W×V1÷V2)
=8.24×(△A测定-△A空白-0.0076) ÷W
V1:加入反应体系中样本体积,0.1ml V2:加入提取液体积,1 ml
Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml W:样本质量,g