测定原理:
HK催化葡萄糖合成 6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化 6-磷酸葡萄糖脱氢生成 NADPH,NADPH 在 340nm 有特征吸收峰。
自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1ml 石英比色皿、研钵、冰、蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:60ml×1 瓶,4°C保存;
试剂一:液体 30ml×1 瓶,4°C保存;
试剂二:粉剂×1 瓶,4°C保存;临用前加入 30ml 蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20°C保存,禁止反复冻融;
试剂三:液体 5ml×1 瓶,4 度保存;
试剂四:粉剂×1 支,-20°C保存,临用前加入 4ml 蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20°C保存,禁止反复冻融;
试剂五:粉剂×1 支,-20°C保存,临用前加入 2ml 蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分后-20°C保存,禁止反复冻融;
试剂六:粉剂×1 支,-20°C保存,临用前加入 250μl 试剂一和 250μl 蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20°C保存,禁止反复冻融。
样本前处理:
样本处理详见说明书。测定组织和细胞同时需要测定蛋白浓度。
操作步骤:
试剂名称 | 测定管 |
试剂一(μl) | 400 |
试剂二(μl) | 400 |
试剂三(μl) | 80 |
试剂四(μl) | 80 |
试剂五(μl) | 40 |
试剂六(μl) | 8 |
样 本(μl) | 30 |
将上述试剂按顺序加入 1ml 石英比色皿中,立即混匀,加样本的同时开始计时,在 340nm波长下记录 20 秒时的初始吸光度 A1 和 5 分 20 秒时的吸光度 A2,计算△A=A2-A1。